抑郁症作为一种精神疾病，因其较高的疾病负担受到广泛关注。抑郁症患者会出现睡眠减少、食欲不振、兴趣降低表现，甚至情绪、思维和认知过程出现异常，严重影响患者生活质量[1]。抑郁症的病理机制研究认为，氧化应激与抑郁症关系密切，氧化应激是指机体内促氧化与抗氧化能力之间失衡，造成活性氧（reactive oxygen species，ROS）积累，导致细胞损伤[2]。大脑消耗氧气较其他器官更多，并富含可氧化脂质，其中ROS nrf2生成也会更多，当ROS和抗氧化剂之间失衡造成脑内氧化应激，可导致神经元DNA的损伤[3-4]。氧化应激参与多种信号转导途径的调节，包括丝裂原活化蛋白激酶（mitogen
activated protein kinase，MAPK）、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）等信号通路[5]，还会激活炎症信号通路如核因子-κB（nuclear
factor-κB，NF-κB），导致促炎细胞因子的释放[6-7]。此外，蛋白质氧化会导致过氧化物还原蛋白2（peroxiredoxin 2，PRDX2）增加致使肿瘤坏死因子-α（tumor
necrosis factor-α，TNF-α
）释放，诱导神经炎症的发生[8]。神经炎症同样与抑郁症密切相关，小胶质细胞是大脑中独特的免疫细胞，可为神经细胞提供营养，维持神经细胞的平衡[9]。小胶质细胞激活后其M1型释放大量炎症因子引发神经炎症，并引起神经营养因子水平降低，破坏神经可塑性，诱导神经元损伤[10-11]。
逍遥散记载于宋代《太平惠民和剂局方》，为疏肝解郁名方，课题组前期研究发现逍遥散的拆方药队柴胡、当归、薄荷（CDB）具有与全方相当的抗抑郁作用，其作用机制可能与影响5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）、脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）水平有关[12-14]，进一步研究发现CDB挥发油部位能通过激活核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related
factor 2，Nrf2）/血红素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）路径调节氧化应激改善嗅球摘除（olfactory bulbectomy，OB）模型大鼠抑郁样行为，被认为是CDB抗抑郁作用的药效物质基础之一[15]。此外，已有报道CDB挥发油中的主要成分藁本内酯能改善慢性不可预知温和应激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）模型诱导的大鼠抑郁样行为[16]；L-薄荷酮也可有效抑制CUMS小鼠海马NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（cystein-asparate protease-1，Caspase-1）蛋白表达，从而抑制神经炎症来改善动物抑郁样行为[17]；L-薄荷醇可增加强迫游泳实验（forced swimming test，FST）小鼠脑组织5-HT、多巴胺（dopamine，DA）、γ-羟基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）水平[18]。由此，可认为CDB挥发油能通过减轻神经炎症反应干预抑郁样行为的发生，故本研究通过建立脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）诱导的小鼠抑郁样模型，探究CDB挥发油能否通过PI3K/蛋白激酶（protein kinase B，Akt）/Nrf2通路改善氧化应激从而干预神经炎症来发挥抗抑郁作用，以期进一步丰富、完善CDB挥发油的抗抑郁作用机制。
SPF级雄性C57BL/6J小鼠，体质量（20±2）g，购自北京斯贝福生物技术有限公司，合格证SCXK（京）2019-0010。所有动物均饲养在成都中医药大学实验动物观察室，许可证号SYXK（川）2020-124，温度（23±2）℃，自由进食进水，24 h明暗交替饲养，昼夜各12 h（8: 00～20: 00）。动物实验经成都中医药大学实验动物伦理委员会批准（批准号20200312）。柴胡（批号200801）购自河北一仁药业有限公司，当归（批号201022）购自四川省中药饮片有限公司，薄荷（批号190702）购自四川利民中药饮片有限公司，经成都中医药大学中药鉴定教研室严铸云教授分别鉴定为伞形科植物柴胡Bupleurum chinense DC.干燥根、伞形科植物当归Angelica sinensis (Oliv.) Diels.干燥根、唇形科植物薄荷Mentha canadensis Linnaeus.干燥地上部分，均符合《中国药典》2020年版规定。LPS（批号0000135947）购自美国Sigma公司；盐酸氟西汀（批号9833A，20 mg/粒，国药准字号J20170022）购自Patheon France公司；小鼠TNF-α试剂盒（批号22B139）购自伊科赛生物科技（太仓）有限公司；小鼠白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）试剂盒（批号E77S8BSLTM）购自Elabscience公司；总超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性检测试剂盒（批号020821210429、020821210603、092721220627）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）检测试剂盒（批号032821210405、050222220714）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（批号120720210429）购自碧云天生物技术有限公司；还原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）测定试剂盒（批号20210602、20220719）购自南京建成生物工程研究所；Nrf2、Akt、PI3K、p-p65兔多克隆抗体（批号分别为TA0639、TU421951、TU410470、TA8229）均购自Abmart公司；HO-1、p-Akt、p-PI3K、p65、BDNF、钙结合衔接分子-1（ionized calcium-binding adapter
molecule-1，Iba-1）兔多克隆抗体（批号分别为82206、4060、4228、8242、47808、17198）均购自美国CST公司；IL-1β兔多克隆抗体（批号AF4006）购自Affinity公司；β-actin兔多克隆抗体（批号GB11001）、GAPDH兔多克隆抗体（批号GB11002）、HRP羊抗兔IgG二抗（批号GB23303）、HRP羊抗鼠IgG二抗（批号GB23301）均购自Servicebio公司；SOD1小鼠单克隆抗体（批号sc-271014）购自Santa Cruz Biotechnology公司。SYNS00000型纯水仪（Minipore公司）；JCS型电子天平秤（英衡电器有限公司）；Varioskan Flash全波长多功能酶标仪、Revos脱水机（美国Thermo Fisher Scientific公司）；63024型悬尾测试箱、63022型强迫游泳筒、63036型灯箱（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）；JB-P5型包埋机、JB-L5型冻台（武汉俊杰电子有限公司）；RM2016型病理切片机（上海徕卡仪器有限公司）；KD-P型组织摊片机（浙江省金华市科迪仪器设备有限公司）；Pannoramic SCAN Ⅱ型病理切片扫描仪（3DHISTECH Kft公司）；DS-U3型成像系统（日本尼康公司）；ChemiDoc免染型化学发光凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）。柴胡、当归、薄荷按配比称取适量装入烧瓶中[19]，加入8倍量的水后，采用挥发油轻油提取器蒸馏6 h，提取过程中以锡箔纸遮住提取器刻度区避光，收集上层挥发油，无水硫酸钠除水，得到黄色油状液体，称定质量，计算得率为0.3%，保存于棕色瓶中，置?20 ℃冰箱备用。经GC-MS测定，CDB挥发油中藁本内酯、薄荷脑、香芹酮、丁烯基苯酞质量分数分别为45.89%、8.03%、4.60%、4.52%[15]。雄性C57BL/6J小鼠按体质量分层随机分为对照组、模型组、盐酸氟西汀（10 mg/kg）组和CDB挥发油高、低剂量（73.6、36.8 mg/kg）组，挥发油剂量设置按前期大鼠实验剂量换算而得[15]。CDB挥发油用3%聚山梨酯80与生理盐水配制。小鼠适应性喂养3 d后开始ig给药（20 mL/kg），对照组和模型组ig等体积3%聚山梨酯80与生理盐水，连续给药16 d。于给药第13～15天，除对照组外其余各组小鼠每日ip 1 mg/kg LPS（20 mL/kg）造模。造模后进行行为学测试，然后麻醉小鼠，眼眶取血分离血清，并在冰台上剖取小鼠全脑及海马组织。2.3.1 糖水偏好测试（sucrose preference test，SPT） 将小鼠单笼放置并禁食禁水24 h，准备1%糖水瓶和纯净水瓶并称定质量，每个笼子上放置1个纯净水瓶和1个糖水瓶，2 h交换2个水瓶的位置，以小鼠4 h内糖水偏好率作为评价指标。2.3.2 强迫游泳实验（ forced
swimming test，FST） 实验前24 h进行强迫游泳训练，保持水温（24±2）℃。将小鼠放入透明圆筒内开始计时6 min，前2 min为小鼠适应时间，记录后4 min小鼠累积不动时间。采用SMART 3.0软件进行数据采集。2.3.3 悬尾实验（tail suspension test nrf2，TST） 将小鼠尾部3分之1处固定在悬尾箱中，倒置悬挂，从悬挂开始计时6 min，前2 min为小鼠适应时间段，记录小鼠后4 min内累计不动时间。以小鼠四肢悬空不动、放弃挣扎为标准。采用SMART
3.0软件进行数据采集。2.4 小鼠血清炎症因子IL-1β、IL-6水平检测小鼠全血室温静置1 h后，3 500 r/min离心15 min，分离血清。根据ELISA试剂盒说明书检测小鼠血清IL-1β和IL-6水平。小鼠取血后立即在冰台上剖取海马组织，置?80 ℃冰箱保存。称取20 mg海马组织加入相应试剂，将海马组织研磨匀浆，12 000×g离心15 min，分离上清液。用BCA法对上清液进行蛋白浓度测定。根据试剂盒说明书检测组织上清液SOD活性及MDA、GSH水平。2.6 nrf2免疫荧光检测小鼠海马CA3区小胶质细胞激活将小鼠全脑于4%多聚甲醛中固定，经包埋后切片。切片脱蜡至水后用柠檬酸缓冲液进行抗原修复，冷却后PBS溶液（pH 7.4）洗涤。组化笔画圈后加入自发荧光淬灭剂，冲洗后血清封闭30 min，然后滴加Iba-1兔源抗体，4 ℃孵育过夜。PBS洗涤后加入荧光二抗避光孵育50 min，PBS洗涤后滴加DAPI避光孵育10 min，再次用PBS洗涤加入抗荧光淬灭封片剂封片。将切片置于荧光显微镜下观察并采集图像，DAPI染出的细胞核在紫外的激发下为蓝色，阳性表达为红色。采用Image J软件进行分析，对每张照片进行分析得出每张照片上阳性的累积荧光强度（integrated optical density，IOD）以及像素面积（AREA），并计算平均荧光强度（average optical，AO）。取小鼠全脑于4%多聚甲醛中固定，经包埋、切片后脱蜡至水，放入预热50 ℃的1%甲苯胺蓝水溶液中染色45 min，水洗终止染色。显微镜下控制分化程度，水洗后烤干，二甲苯透明后加入中性树胶封片。对小鼠海马CA3区进行图像采集，脑组织尼氏体呈深蓝色，背景淡蓝色。应用Image-Pro
Plus 6.0软件选取相同的蓝色作为判断所有切片图像阳性的统一标准，方法同“2.6”项，计算AO值。2.8 Western blotting检测海马BDNF、PI3K/Akt/ Nrf2以及NF-κB通路相关蛋白表达称取小鼠海马组织20 mg，加入200 μL RIPA裂解液（RIPA∶蛋白酶抑制剂∶磷酸酶抑制剂＝98∶1∶1）。低温匀浆后冰上裂解1 h，12 000×g离心15 min，取上清液，BCA法测定蛋白浓度，加入蛋白上样缓冲液制备海马组织样本。蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，封闭后，4 ℃孵育对应的一抗过夜，第2天洗膜后孵育二抗，洗膜后在凝胶成像系统中成像，并通过Image Lab软件分析p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、Nrf2、HO-1、SOD1、BDNF、p-p65、p65、IL-1β、Iba-1蛋白表达。使用SPSS 26.0统计软件分析数据，数据以表示，计量数据符合正态分布使用单因素方差分析（One-way ANOVA），非正态分布数据使用非参数检验分析。3.1 CDB挥发油对LPS诱导的抑郁样小鼠行为学的影响如表1所示，与对照组比较，模型组小鼠糖水偏好率明显降低（P＜0.001），FST、TST的不动时间显著延长（P＜0.001），表明ip
LPS可导致小鼠快感缺失和奖赏机制缺乏，绝望行为明显增加，使动物出现抑郁样行为表现。与模型组比较，各给药组小鼠糖水偏好率明显升高（P＜0.01），TST不动时间显著缩短（P＜0.05、0.01），CDB挥发油高剂量组FST不动时间显著缩短（P＜0.01），表明CDB挥发油能改善动物抑郁样行为。3.2 CDB挥发油对LPS诱导的抑郁样小鼠血清炎症因子水平的影响如表2所示，与对照组比较，模型组小鼠血清IL-1β和TNF-α水平显著增加（P＜0.001）。与模型组比较，CDB挥发油各剂量组小鼠血清中IL-1β、TNF-α水平显著降低（P＜0.01），盐酸氟西汀组TNF-α水平显著降低（P＜0.01）。3.3 CDB挥发油对LPS诱导的抑郁样小鼠海马组织氧化应激水平的影响如表3所示，与对照组比较，模型组小鼠海马MDA水平显著增加（P＜0.01），GSH水平及SOD活性显著降低（P＜0.05、0.01），提示LPS可诱导小鼠中枢呈现氧化应激表现。与模型组比较，CDB挥发油高剂量组和盐酸氟西汀组MDA水平显著降低（P＜0.05），GSH水平及SOD活性均显著升高（P＜0.05），提示CDB挥发油能抑制LPS诱导的氧化应激反应。3.4 CDB挥发油对LPS诱导的抑郁样小鼠海马CA3区小胶质细胞激活标志物Iba-1表达的影响如图1和表4所示，与对照组比较，模型组小鼠海马CA3区Iba-1表达显著增加（P＜0.001），提示LPS可刺激中枢小胶质细胞激活，从而引起中枢神经炎症，进而致使小鼠的行为学异常。与模型组比较，CDB挥发油高剂量组和盐酸氟西汀组小鼠海马CA3区Iba-1表达显著下调（P＜0.05、0.01），表明CDB挥发油能有效抑制LPS诱导的神经炎症。3.5 CDB挥发油对LPS诱导的抑郁样小鼠海马CA3区尼氏小体的影响如图2和表5所示，与对照组比较，模型组小鼠海马CA3区尼氏小体AO值显著降低（P＜0.001），提示模型组小鼠海马CA3区神经元有损伤。与模型组比较，各给药组海马CA3区尼氏小体AO值均显著降低（P＜0.05、0.01），表明CDB挥发油能够有效改善神经元损伤。3.6 CDB挥发油对LPS诱导的抑郁样小鼠海马BDNF、PI3K/Akt/Nrf2与NF-κB通路相关蛋白表达的影响 如图3和表6、7所示，与对照组比较，模型组小鼠海马组织BDNF蛋白表达水平显著降低（P＜0.01），提示LPS诱导的小鼠抑郁症模型成功[20]。模型组小鼠海马组织p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、Nrf2、HO-1和SOD1蛋白表达水平均明显降低（P＜0.05、0.01、0.001），提示模型组小鼠PI3K/Akt/Nrf2通路被抑制，与氧化应激反应有关。模型组小鼠海马p-p65/p65有升高趋势，IL-1β和Iba-1蛋白表达水平显著升高（P＜0.01），提示模型组小鼠出现神经炎症。与模型组比较，CDB挥发油高剂量组BDNF和PI3K/Akt/Nrf2通路相关蛋白表达显著上调（P＜0.05、0.01），IL-1β和Iba-1蛋白表达水平均显著下调（P＜0.05、0.01），提示CDB挥发油能通过调节PI3K/Akt/Nrf2信号通路发挥抗氧化作用并抑制神经炎症，从而达到抗抑郁样行为目的。
逍遥散的拆方药队CDB是基于功能药队拆方研究模式获得的与逍遥散抗抑郁作用相当的精简方，方中柴胡疏肝解郁，调节气机；当归养血和肝，补其亏损；薄荷增强升发疏泄，疏肝理脾。前期研究已证实CDB对CUMS模型动物有良好的抗抑郁作用，作用机制与升高5-HT、BDNF水平及调节下丘脑-垂体-肾上腺（hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA）轴功能亢进有关[12,21]。因方中柴胡、当归、薄荷3味药物的挥发油含量均较为丰富，而芳香疗法也被认为是缓解抑郁症的有效疗法，挥发油及其有效成分易于透过血脑屏障，能快速与中枢神经系统受体相互作用而改善患者的焦虑和抑郁状态[22-23]。GC-MS分析发现CDB挥发油主要成分包括藁本内酯、薄荷脑、异薄荷酮等，上述成分均有通过抑制小胶质细胞激活、抑制炎症因子的释放、抑制神经元凋亡等作用来发挥抗抑郁作用的报道[16,24]，提示CDB挥发油可能是CDB抗抑郁作用发挥的主要有效部位之一。此外，课题组前期OB大鼠模型实验已表明CDB挥发油抗抑郁作用的发挥与激活Nrf2/HO-1路径调节氧化应激有关，氧化应激与神经炎症反应相关联，两者均被认为参与到抑郁症发生发展的病理过程中。OB模型是通过手术摘除动物嗅球以模拟抑郁症患者嗅球萎缩，诱导动物出现激越性抑郁样行为，动物水平运动会显著增加[25]；而LPS诱导的抑郁样行为对动物的自主活动影响不突出，但2种动物模型均会表现出氧化应激的发生，其中LPS模型相对更适合观察药物抗抑郁作用与抑制炎症反应的关联。本研究主要采用LPS诱导的抑郁样小鼠模型，进一步探究CDB挥发油的抗抑郁作用及其干预PI3K/Akt/Nrf2信号通路从而影响炎症反应的作用机制，为CDB挥发油的深入研究奠定一定基础。LPS诱导的动物抑郁样模型已被广泛报道，ip LPS可引起动物血脑屏障通透性改变，诱发动物神经炎症和氧化应激，致使动物出现抑郁样状态[26-28]。本研究结果表明，ip LPS所建立的小鼠抑郁样模型，小鼠出现糖水偏好率降低，FST和TST的不动时间明显延长，提示造模成功。此外，模型小鼠海马组织MDA水平升高，GSH水平和SOD活性降低，呈现氧化应激状态；模型小鼠血清TNF-α、IL-1β水平升高，海马小胶质细胞被激活，呈现炎症反应；小鼠海马CA3区尼氏小体消失，出现边界模糊的形态，且神经元密度降低，神经元出现损伤。表明该模型呈现氧化应激表现及神经炎症反应，从而引起海马部位神经元损伤，由此与抑郁样行为的发生相关。研究发现，通过CDB挥发油的前处理，能明显对抗模型小鼠上述各项指标的异常，如降低海马MDA水平，提高GSH水平及SOD活性，抑制氧化应激；降低血清TNF-α、IL-1β水平，抑制海马小胶质细胞的激活，升高CA3区尼氏小体AO值，发挥神经保护作用。CDB挥发油高、低剂量均能有效改善模型小鼠的抑郁样行为，调节MDA、GSH、TNF-α、IL-1β水平和SOD活性，并增加海马尼氏小体数量，抑制海马Iba-1表达。因此进一步的机制研究中，选用药效相对为优的CDB挥发油高剂量（73.6 mg/kg）组的样本开展其对PI3K/Akt/Nrf2信号通路影响的工作。Nrf2是与氧化应激和神经炎症密切相关的蛋白，Nrf2可识别DNA损伤并发挥修复和清除作用，且Nrf2能调节BDNF与IL-10发挥保护作用[29-30]。BDNF作为神经营养蛋白家族中调节学习、记忆和神经可塑性有关的蛋白，研究证实抑郁症患者海马和前额叶皮层BDNF表达明显降低[20]，可作为临床诊断抑郁症的辅助指标之一。氧化应激发生时会导致Nrf2受到抑制，并与PI3K/Akt信号通路抑制相关，而PI3K/Akt-Nrf2通路的抑制则使抗氧化作用减弱，又会诱导NF-κB信号通路的激活[31]。本研究发现，LPS诱导的模型小鼠海马组织中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、Nrf2、HO-1、SOD1和BDNF的蛋白表达量明显降低。与模型组比较，CDB挥发油组上述相关蛋白表达量明显上调，并且有降低p-p65/p65表达的趋势，显著抑制海马部位Iba-1、IL-β的表达，提示CDB挥发油可能通过激活PI3K/Akt/ Nrf2信号通路提高抗氧化作用，并抑制NF-κB信号通路减轻神经炎症反应从而发挥抗抑郁作用。此外，前期研究表明CDB挥发油在46 mg/kg、23 mg/kg剂量下灌胃给予OB模型大鼠有良好抗抑郁作用，本研究中依据大鼠有效剂量等效换算为小鼠给药剂量73.6、36.8 mg/kg，相当于原生药量24.5、12.3 g/kg。该剂量远低于前期研究所发现的CDB石油醚部位（与挥发油成分基本一致）半数致死量（50% lethal dose，LD50）的剂量，此剂量为临床日用剂量1 554倍，生药量为851.4 g/kg[32]。实验过程中对小鼠的一般观察也未见异常情况，可认为本研究中采用的CDB挥发油剂量安全性高。综上，CDB挥发油能改善LPS诱导的小鼠抑郁样行为，增加海马CA3区尼氏小体的合成，表现出神经保护作用，作用发挥与其调节PI3K/Akt信号通路激活Nrf2/HO-1信号通路，提高GSH水平及SOD活性，降低MDA水平发挥抗氧化作用有关；以及进一步影响NF-κB信号通路，抑制海马小胶质细胞激活来抑制神经炎症反应有关。但本研究尚未使用相关抑制剂阻断关键蛋白表达后进行反向验证，后续实验可从此角度开展深入研究，以明确CDB挥发油对氧化应激和神经炎症影响的分子机制。来 源：谢志强，胡靖文，曾九僧，陈 力，谢红潇，方 洋，曾 南．基于PI3K/Akt/Nrf2信号通路研究逍遥散拆方药队挥发油部位对脂多糖致抑郁样模型小鼠的作用及机制 [J]. 中草药, 2024, 55(7): 2283-2291.
