冰冻切片技术，你了解吗？
中心的冰冻切片机，你会用吗？
最近分子影像中心的俞文君、方义杰同学
向我们介绍了冰冻切片的制备流程与注意事项
并专门录制了冰冻切片机的使用视频
备物
切片机使用视频
- 提前标记玻片，分清玻片正反面及组织类型
- 提前将样品托放入切片机中，有利于缩短实验时间
取材
1. 动物实验前明确是否需要做冰冻切片，如需要提前准备耗材。
切片冻存所需耗材
2. 标本必须新鲜（标本离体后立即处理），切勿放入酒精或甲醇中，取材过程中器械应保持干燥，组织不能冲水，以防变形。
3. 组织块大小、厚薄适宜，取材厚度在0.5cm左右。
4. 尽量保持组织的原有形态及完整性。
5. 选择好组织切面，保持组织清洁（可用PBS清洗）。
6. 取材避免不必要的脂肪组织，异物要剔除。
7. 如遇含水量高的标本时，应尽量用干纱布吸干水分后再行冷冻，避免由于冰晶形成造成诊断上的失误。
8. 一旦获得新鲜组织，第一时间将样本按照需要角度在OCT中包埋和液氮中冻存；尽量避免先将组织样品冻存在-80℃中保存（组织质量会下降）。
二、冷冻样品的固定
1. 在标本托上涂一层冷冻包埋剂OCT，然后将取材后的新鲜标本安放在标本冷冻托上，用OCT包埋剂沿着组织周围对标本覆盖。
2. 组织较小或较薄时，可先将OCT滴加在标本托上，冻成一个小冷台，将组织放在小冷台上，再覆盖OCT冷冻，并用冷冻锤轻轻压平。
切片
一、样品固定
温度是冰冻切片制作中的重要环节。
冷冻前将恒温冷冻切片机的速冻头温度和箱内温度调整到适宜的切片温度，一般为-25°C ~-18 °C。
温度过高，组织过软，不能切片；温度过低组织变脆、易碎。
冷冻切片机温度选择表（经验值）
来源 LeicaCM1860/CM1860UV 说明书
二、切片
1. 将标本托固定在切片机的机头上，调整机头的位置。
2. 以粗切削的方式切削至暴露标本的最大平面，用毛笔清除机头、标本托及刀片上的组织碎屑。
3. 确认切片的厚度，根据组织的不同可适当调整切片的厚薄。
4. 放下防卷板使其位置恰好与刀片的刀刃完全平行并略突出刀刃（约0.2mm）。
2. 样品放置
3. 样品修片
冰冻切片注意事项
- 脂肪最后切。脂肪由于硬度不够，对绝大多数组织均适合的温度却切不好脂肪组织。如果组织中的脂肪先接触刀片，脂肪破碎并使整个片子损坏。如果脂肪最后接触刀片，则切片过程不受干扰。
非常坚实的组织容易产生横皱，切片时应包埋成角且尽可能的加温。
上皮和粘膜贴附的组织切片时，应当使上皮面垂直于刀片。
切片时，观察窗不可打开过大，以防温度升高影响切片。
每一例冷冻切片完成后都应及时清理冷冻组织碎屑，以防造成污染。
切片污染是病理组织制片的大忌，在冰冻切片粗削后必须用毛笔清洁碎屑，以防其他组织碎屑沾染到正在切片的标本上。
常见问题及处理办法
组织块大小要适宜，冷冻切片机内切片刀切片机使用视频移动的范围有一定的限制，超出其范围时，易致切片不全。一般情况下，冰冻切片的组织大小为1.5×1.5cm，厚度为2mm。
组织块过大，切片时阻力较大，易产生皱折，刀痕，组织易崩碎，增加制片难度，影响诊断。
如需在同一标本托上放大于两块组织时，应尽量冻成一个平面，与刀锋平齐，以防切片不完整。
若送检组织过小，请预先速冻一冷台面，再行包埋，利于制片。包埋时，应将组织平放在冻头中央。
常见原因：主要取决于组织含水量的大小，尤以组织细胞水肿，淋巴结，纵隔肿瘤，卵巢肿瘤为甚。送检取材过程中接触水源，是造成冰晶形成的原因。
处理方法：组织送检取材时，尽量避开水源；如遇含水量高的标本时，应尽量用干纱布吸干水分后再行冷冻，避免由于冰晶形成出现诊断上的失误。操作者的动作应迅速。
三、切片皱缩或卷缩
常见原因：①刀锋变钝。②防卷板粘有异物。③ 防卷板与刀锋的位置不平行、不协调。④ 组织块包埋不完全，缺乏支撑作用。
处理方法：①注意检查刀具，及时更换刀口，定期磨刀。② 保持防卷板的清洁，每做一例冷冻切片，均应将刀口及防卷板拭擦干净，防止切片的污染和切片皱缩。③调整刀、防卷板的位置，保证两者平行，且防卷板比刀锋前0.2mm左右。④包埋组织应完全，没法切片者再滴加包埋胶。
四、切片脱落
1. 冰冻切片操作指南
