作者:程松???
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摘要：本研究从罹患上呼吸道感染的猫鼻拭子样本中分离到一株疑似菌株。16SrRNA基因检测与测序结果表明，该菌株属于典型猫败血波氏杆菌，与标准菌株NBRC13691的同源性为99%，该细菌可以在鲍-姜氏平板上生长，菌落呈现圆形、光滑、边缘整齐。生化反应试验结果显示，该菌株符合波氏菌属细菌典型反应特征；药敏试验结果显示，该菌对氯霉素、新霉素、红霉素等敏感，对氨苄西林、链霉素、利福平、磷霉素和呋喃唑酮耐药。该菌株对小鼠具有较强的毒力，其半数致死量为：LD50为6.7×108CFU；对猫的感染试验结果显示，该菌株对猫具有较强的致病性，能引起典型上呼吸道症状。综上所述，我们成功分离到一株对猫具有强致病性的支气管败血波氏杆菌，为宠物支气管败血波氏杆菌的检测和疫苗研发奠定了物质基础。
关键词：支气管败血波氏杆菌；分离鉴定；生化试验；耐药性；致病性
支气管败血波氏杆菌（Bordetella bronchiseptica，Bb），又译为支气管败血波氏杆菌，属于产碱杆菌科，博德特菌属。该菌呈两极着色，革兰氏染色阴性，球杆状，单个或成双排列，周身有鞭毛，在鲍-姜氏血平板上呈光滑隆起、半透明、湿润的形态[1]。支气管败血波氏杆菌最初由Ferry于1910年从患有上呼吸道感染疾病德犬中分离出来。随后的研究证明，该菌可引起猪、兔、犬、猫、马等多种动物的上呼吸道感染疾病。例如，犬窝咳、猪传染性萎缩鼻炎，及兔传染性鼻炎[2]。加拿大在某项调查中，对36例犬和31例猫呼吸道感染的病例分析，波氏杆菌检测结果为阳性的犬有8例、猫有14例[3]。此外，针对英国的调查表明，对不同群体的猫进行细菌分离时，发现有多达11%的猫分离出波氏杆菌，且幼猫感染比例更高[4]。我国对于波氏杆菌的研究主要针对猪及兔，对于犬和猫的研究较少。幼犬及幼猫易感并可引起支气管肺炎，机体感染该菌后往往容易继发感染其他细菌和病毒，导致更严重的呼吸道疾病。
因此，本研究对于患病猫的鼻咽拭子进行病原菌的分离与鉴定，并对分离菌株进行药敏试验、生化实验、小鼠的毒力实验及猫的致病性实验，为该菌病原学的研究及该病的诊断治疗奠定基础。
1 材料与方法
1.1 样本来源
疑似患有波氏杆菌感染的病猫的眼口鼻拭子。
1.2实验动物
18-22g ICR雌性小鼠购自上海杰思捷实验动物有限公司；使用特定病原阴性猫3只，8~12周龄。
1.3 主要试验材料
胰蛋白胨大豆肉汤培养基购自海博生物公司；鲍-姜氏培养基购自奥博型制造有限公司；麦康凯琼脂购自海博生物公司；脱纤羊血购自上海源叶生物科技有限公司；新生牛血清购自上海源叶生物科技有限公司；药敏试纸购自温州康泰公司；生化管购自杭州滨和微生物公司；DNA marker DL2000购自南京诺唯赞有限公司；恒温培养箱购自美国精骐有限公司公司；PCR 仪购自日本Nikon公司；超净工作台购自苏州安泰空气技术有限公司。
1.4 试验方法
1.4.1 细菌分离培养
用无菌棉拭子采集临床症状为咳嗽、有脓性或浆液性鼻液的患病猫鼻液病料，置于 1 mL PBS 中，充分混匀，无菌接种于麦康凯琼脂平板37 ℃培养36 h。挑取疑似菌落在10% 脱纤无菌羊血鲍-姜氏平板上培养36h，连续纯化三代。挑取单菌落于含有5%新生牛血清的TSB 液体培养基中37 ℃培养约12h。
1.4.2 分离细菌染色、镜检
挑取1.4.1中鲍-姜氏平板上纯培养的单一菌落涂抹于洁净载玻片上，采用革兰染色液进行染色，置于显微镜下，采用油镜观察分离细菌的形态结构、染色特点。
1.5 试验方法
将分离菌接种于5%新生牛血清的TSB液体培养基中培养至对数期，用16S rRNA （E06073.1）通用引物（F:5′- GATCAAACTCTTCAGTTCA-3′，R:5′- AGTCGTAACAAGGTAGCC-3′）扩增分离细菌的16S rRNA基因片段。鉴定正确的PCR产物送至上海生物工程技术服务有限公司测序。将测序获得的序列与NCBI核酸序列数据库进行同源性比对，鉴定属种。
参见文献[5]已建立的PCR检测方法，使用引物(F：5′-AGGCTCCCAAGAGAAAGGCT-3′ ; R：5′-TGGCGCCTGCCCTATC-3)可扩增出 237bp的支气管败血波氏杆菌鞭毛基因片断，以检测支气管败血波氏杆菌。
1.6 生化鉴定试验
将经过鲍-姜氏血平板纯化后的单菌落分别接种于细菌微量发酵管进行以下各项生化试验：葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、三糖铁、肌醇、山梨醇、甘露醇、明胶、硫化氢、VP、MP、靛基质、氧化酶，枸橼酸盐、尿素、硝酸盐实验，于 37℃培养36h。
1.7 药敏试验
采用Kirby-Bauer纸片扩散法对支气管败血波氏杆菌进行药敏试验。挑取单菌落于5%新生牛血清的TSB培养基中培养至菌液浓度为1.5×108CFU/m L(0.5麦氏比浊度），吸取菌液100μL至10%脱纤羊血鲍-姜氏平板上涂布，正放5min后，将药敏纸片贴片，然后将平板倒置于 37 ℃ 恒温培养箱中培养36h，分别测量每种药物的抑菌圈直径，根据CLSI标准判断药物敏感性。选取34种药敏纸片包括氨苄青霉素、羧苄青霉素、先锋霉素V、青霉素、卡那霉素、庆大霉素、新霉素、红霉素、万古霉素、氯霉素、林可霉素、克林霉素、头孢曲松、头孢他啶、头孢哌酮、头孢氨苄、头孢拉定、头孢呋辛、头孢唑林、多西环素、四环素、米诺环素、苯唑西林、羧苄西林、哌拉西林、氨苄西林、丁胺卡那、氧氟沙星、环丙沙星、诺氟沙星、美罗培南、亚胺培南、呋喃唑酮、多粘菌素B。
1.8 生长曲线测定
将分离株于含5%新生牛血清的TSB中培养至OD600=1.0。吸取菌液按1:1000重新置于培养基中培养，37℃，220 rpm，每隔2h测量一次OD600 并活菌计数。当测量的OD600值高于1.0时，将菌液稀释一倍后测量；当测量的OD600高于1.5时，将菌液稀释三倍后测量。每组设置三个重复，将获得的数据绘制生长曲线。
1.9 小鼠致病力测定
将分离株经含5%新生牛血清的TSB液体培养基培养12 h后，用无菌PBS将菌量调整为1×1011 CFU、1×1010 CFU、1×109CFU、1×108 CFU、1×107 CFU、 1×106 CFU，将每一稀释度分别腹腔注射10只18～22g ICR小白鼠每组隔离饲养，PBS做空白对照。接种后每天观察 2次，连续观察7d记录各组小鼠的死亡情况，剖检死亡小鼠取病变组织做细菌的分离与鉴定。
1. 10 对猫的致病性试验
将分离株经含5%新生牛血清的TSB液体培养基培养12 h后，用无菌PBS将菌量调整为5×109 CFU/ml，将3只2-3月龄阴性健康猫滴鼻接种1mL菌株，连续观察7天实验猫的临床症状并集口鼻拭子，将拭子置于1ml PBS中充分混匀后，进行细菌的分离鉴定及PCR检测。
2 结果
2.1 分离鉴定结果
将本研究分离的支气管败血波氏杆菌，命名为GZ2303株。该菌株在麦康凯琼脂平板上生长良好，菌落红色，周围有狭窄红色环，培养基着染琥珀色（如图1A）。在10% 脱纤无菌羊血鲍-姜氏平板上培养36h后，菌落圆形、光滑隆起、湿润、边缘整齐，直径0.5-1 mm（如图1B）。光学显微镜下观察细菌的形态和染色特性为球杆状，单个或成双排列，两极着色，革兰氏染色阴性（如图1C）。
图1.A：麦康凯平板上的菌落形态；B：血琼脂平板上的菌落形态；C：革兰氏染色后的细菌形态
2.2 分子鉴定及进化树分析结果
对GZ2303株的16S rRNA 进行扩增，成功获得长约1 500 bp的条带（图2A）。对该扩增产物进行测序鉴定，并与NCBI数据库中相关序列进行比对。结果证明该分离菌株为支猫源气管败血波氏杆菌。进一步使用PCR方法，检测Bb GZ2303株的鞭毛基因，结果也从该分离株中成功扩增出长约237bp的基因片断（图2B），测序结果再次证明该分离株为猫的支气管败血波氏杆菌。
图2.PCR鉴定Bb GZ2303结果
A: GZ2303株16sRNA基因扩增结果; B: GZ2303株鞭毛基因PCR扩增结果;
M: DNA Marker DL 8000; 1-6:单菌落。
根据Bb16S rRNA序列，对GZ2303株进行遗传进化分析，如图3所示，GZ2303株与NR 025950.1、MN082542.1、ON920550、ON920544.1分离株亲缘关系最近，属于同一进化分支。
图3. 基于16S rRNA序列的进化树
2.3 生化鉴定试验结果
分离菌株GZ2303株与标准株JQ051012的生化反应结果进行对照相符合，不分解糖类，葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、三糖铁、肌醇、山梨醇、甘露醇均为阴性；明胶、硫化氢、MP、VP、靛基质为阴性；能产生氧化酶、脲酶；能还原硝酸盐；能利用枸橼酸盐。
2.4 药敏试验结果
GZ2303分离株药敏结果显示，该分离株对头孢菌素（头孢哌酮、头孢他啶、头孢曲松），对青霉素类（羧苄西林、氨苄青霉素、羧苄青霉素、哌拉西林）、氯霉素类（氯霉素）、氨基糖苷类（新霉素、丁胺卡那、庆大霉素、卡那霉素）、四环素类（米诺环素、多西环素）、大环内酯类（红霉素）、喹诺酮类（环丙沙星、氧氟沙星）、多肽类（多粘菌素B）18种抗生素敏感。
2.5 一步生长曲线测定
在含有5%新生牛血清的TSB中测定了分离株GZ2303的生长状况可知（如图4），GZ2303菌株在 4h内处于生长适应区，在4h-14h左右处于对数生长区，在14h-24h左右处于生长稳定期。
图4.Bb GZ2303株一步生长曲线
2.6 毒力测定结果
分别以1×1011CFU、1×1010CFU、1×109CFU、1×108CFU、1×107CFU、1×106CFU的支气管败血波氏杆菌GZ2303株腹腔注射感染小鼠连续观察7d（如表1），根据累计数推算法计算出该分离株的半数致死量为6.25×108CFU。剖检死亡小鼠取肺部组织接种于鲍-姜氏血平板上，根据1.3.3的方法进行PCR鉴定，结果为支气管败血波氏杆菌。
2.7 猫致病性试验结果
感染支气管波氏杆菌的三只小猫均在感染三天后开始打喷嚏、流鼻涕、略微鼻塞，四天后开始阵发性咳嗽、精神不济、食欲略微下降。支气管败血波氏杆菌感染猫后每日采集鼻咽拭子，进行PCR检测（如图5A），结果显示攻毒第2日起开始持续性排毒。采集鼻咽拭子接种于鲍-姜氏血平板上（如图5B），根据2.2进行PCR鉴定，结果为支气管败血波氏杆菌(如图5A)。
图5.A: GZ2303鞭毛基因PCR检测结果；B：血琼脂平板上的菌落形态；
M: DNA Marker DL 2000;1: 阴性对照; 2-6: 鼻咽拭子PCR检测; 7: 菌液PCR检测。
3 讨论
猫上呼吸道疾病（FURTD）是由病原感染引起的一类以呼吸道粘膜炎症和眼部疾病为主要特征的呼吸道疾病症候群，常见病原有疱疹病毒（FHV）、杯状病毒（FCV）、支原体（Ms）、衣原体（Cf）和波氏杆菌（Bb）[6]。支气管败血波氏杆菌是引起幼猫支气管肺炎的重要病原菌之一，波氏杆菌在健康和患病的犬猫呼吸道的核酸检出率约在20%-60%，波氏杆菌为条件性致病菌，与多种呼吸道病毒或细菌通过原发性或继发性的协同作用使呼吸道症状更为严重。感染Bb的猫初期主要症状为打喷嚏，鼻塞[7]，随后发展为支气管肺炎并出现阵发性咳嗽、精神不振、厌食等[8]。病理分析可以观察到支气管上皮出现局部的坏死灶，呼吸道纤毛出现化脓性炎症反应，并且根据感染的严重程度，会观察到与纤毛相关的细菌聚集[9]。支气管败血波氏杆菌对人和动物均具有致病性，引起呼吸道疾病，尤其在伴侣动物中波氏杆菌的感染情况尤为常见，而犬猫与人接触密切，因此该菌不仅仅影响宠物的健康，对人也有潜在威胁，对波氏杆菌的研究具有重要的公共卫生意义[10-12]。
本研究于2023年9月从广州某宠物医院采集了疑似支气管败血波氏杆菌感染的眼口鼻拭子进行病原菌的分离、纯化和16S rRNA基因的PCR鉴定，并进一步进行药敏试验、生化反应、生长曲线测定、小鼠毒力试验及猫的致病性试验，以分析其生物学特性和致病性特点。临床养殖中对波氏杆菌的治疗主要以抗生素治疗为主，因此我们对GZ2303株进行了药物敏感性试验，药敏试验结果显示，分离菌对头孢菌素、青霉素类、氯霉素类、氨基糖苷类、四环素类、大环内酯类、喹诺酮类、多肽类，共18种抗生素敏感。猫源波氏杆菌与猪波氏杆菌[13]、兔波氏杆菌[14]、犬波氏杆菌[15]的药物敏感性存在明显差异。药敏试验结果同时表明，GZ2303株多重耐药，多重耐药菌株限制了临床用药的范围，同时，波氏杆菌作为潜在的人畜共患病原菌，对人类的健康也造成巨大的威胁。
此外，通过对小鼠进行毒力实验，表明该菌株对小鼠有较强的毒力。猫致病性试验结果显示，该菌株能成功复制出上呼吸道感染的症状，从感染猫中能检测及分离到支气管败血波氏杆菌。
目前国内宠物市场日益繁盛， 波氏杆菌在猫中的感染率逐步增加，目前暂时没有针对猫用的商品化疫苗。本研究成功分离到一株纯净性好、对猫致病力强的菌株GZ2303，动物回归试验中可引起幼猫出现波氏杆菌感染的典型症状，该菌株为波氏杆菌病的药物治疗、临床防控和疫苗开发奠定了菌种基础。
参考文献 略
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