梁剑峰（梁剑峰人物经历）

脑胶质瘤是最常见的原发CNS肿瘤，目前对预后判断最有意义的分子分型是异柠檬酸脱氢酶（IDH）突变型及野生型，前者预后更好。而IDH野生型恶性胶质瘤是最常见的恶性胶质瘤，美国每年有12000名新发病例，5年生存率仅为6.8%，即使采用最安全的手术切除，放疗及替莫唑胺治疗，mOS也仅为16m。因此目前有大量的临床前研究及临床研究均集中在恶性胶质瘤的治疗上，显示出该肿瘤进展的迅速及巨大的未被满足的临床需求。该文章主要探讨了为何其它瘤种的免疫治疗取得显著进展而胶质瘤却收效甚微。

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ICI反应的生物标志物存在差异

1） TMB: 2020年，FDA批准帕博丽珠单抗用于治疗TMB-H（≥10mut/mb）的实体瘤，其中包括脑胶质瘤。然而脑胶质瘤患者的临床研究结果却并没有显示高TMB会带来治疗获益。Gromeier教授等对WHO 4级恶性胶质瘤患者ICI治疗前的活检标本进行回顾性分析，发现这些患者给予重组病毒或ICI治疗后TMB低（≤1.3mut/mb)的患者生存期较TMB高者更长，给予重组病毒治疗和采用ICI治疗的患者，低TMB和高TMB患者OS分别为17.1m vs 10.7m，15mvs 10m。McGrail教授等对1551名癌症患者（包括207名恶性胶质瘤）的活检标本进行回顾性分析，发现黑色素瘤，NSCLC及膀胱癌患者CD8+ T细胞数量同新生抗原负荷成正相关，高TMB(T≥10 mut/mb ) 对比低TMB患者ORR分别为39.8% vs 4.1%。而与之相反，乳腺癌、前列腺癌和脑胶质瘤患者高TMB患者的ORR要低于低TMB患者。提示不同的癌种有着截然不同的免疫生化基础。

2）PD-L1，dMMR和MSI:恶性胶质瘤中仅<1%的患者存在MSI，不足10%的患者有高TMB、PD-L1高表达或dMMR，仅30%的患者能够检测到T细胞浸润。2020年12月一项小鼠研究数据提示存在dMMR的肿瘤细胞能够大量积聚胞内DNA并以cGAS–STING依赖的方式产生干扰素，使肿瘤隐匿这种改变，缓慢进展并对ICIs治疗高度敏感。但这种缺陷在脑胶质瘤大规模数据库，如国家癌症基因库中却没有看到。相反，在脑转移癌中却经常见到一种或多种的生物标志物改变。我们认为，由于恶性胶质瘤有着复杂的异质性和抗肿瘤免疫反应，单一的参数很难作为有效的免疫治疗预测标志物。但可以作为多聚配体分析中的一个必要组分。

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肿瘤免疫构成及反应的差异

1）构成差异：2020年6月发表的一篇采用免疫荧光分类细胞以及单细胞RNA测序的研究，比较了原发脑胶质瘤和脑转移癌患者肿瘤微环境（TME）中免疫细胞的差异。结果显示二者的免疫细胞浸润部位，种类均存在显著差异，提示TME是由疾病本身形成而非依赖于肿瘤周围的脑组织。这些差异也部分解释了二者ICI治疗疗效的差异。过去我们认为巨噬细胞分为M1（肿瘤支持型）和M2型（肿瘤抑制型），并且该理论被广泛接受，然而脑小胶质细胞和单核巨噬细胞的转录分析结果显示，不同的脑肿瘤有着更为复杂和多面化的表型，并非仅限于M1和M2。另外有研究单独研究了骨髓细胞群体，发现了小胶质细胞和巨噬细胞的异质性和可塑性，发现MDM（myeloid- derived monocyte/macrophage髓源性单核细胞/巨噬细胞）能够穿过血-脑屏障进入肿瘤。进一步研究发现，MDMs能够提高免疫抑制因子如IL-10和TGFβ2的水平,提示MDM或许可以成为潜在的治疗靶点。

2）免疫反应性的差异

CNS免疫细胞的构成差异不仅显示在类别上，还体现在空间位置的不同，下图显示的是恶性胶质瘤患者不同CNS解剖部位免疫细胞的类别情况差异。目前，更多的研究集中在肿瘤的核心区域而较少涉及肿瘤—CNS交界区域。而该区域很可能有免疫反应激发，上调免疫因子表达，其作用类似于CNS特异性的趋化因子，趋化小胶质细胞、巨噬细胞和单核细胞。一项研究肿瘤不同部位，从肿瘤-脑组织交界区到肿瘤核心部位的免疫细胞分析中，研究者用多元染色方法发现，同脑胶质瘤相比脑转移癌患者在肿瘤-CNS交界区有更多的APC-T细胞聚集（图1）。

图1.CNS不同部位免疫细胞类别及表达

CNS不同部位趋化因子表达

CT, 肿瘤细胞; HPV, 肿瘤细胞增生血管; IT, 肿瘤浸润; LE, 前缘; MDM, 髓源性单核/巨噬细胞MP, 为血管增生; PS, 坏死周围细胞; PZ, 坏死周边区域.

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免疫抑制因子富集

目前发现的免疫检查点包括PD-1/ PD- L1,CTLA4, LAG3,TIM3等，那么脑胶质瘤患者TME中这些抑制性检查点表达情况如何呢？2020年9月发表的一项研究对不同级别和分子亚型脑胶质瘤患者进行免疫细胞分析，分离脑胶质瘤患者TME中的T细胞和单核细胞，巨噬细胞，同无脑胶质瘤的患者进行比较后发现，胶质瘤患者中最常见表达的是免疫抑制腺苷受体（A2a），其次是PD-1（表1）。腺苷受体广泛表达于多种免疫细胞，包括巨噬细胞、T细胞和NK细胞、树突细胞。通过激活配体可以诱发多种免疫抑制信号通路。尽管小鼠研究提示抑制A2a受体功能能够部分恢复效应T细胞的功能，但当T细胞同胶质细胞共同孵育时，则T细胞的耗竭不可恢复。

表1. 脑胶质瘤和脑转移癌免疫细胞特征和部位差异汇总

既往研究显示恶性胶质瘤患者的T细胞耗竭非常严重，表现为多种免疫检查点水平显著上调，因此对ICI抑制剂无反应。而且这种免疫细胞耗竭不仅限于T细胞，Shaim等研究发现恶性胶质瘤患者NK细胞表型发生变化同时杀伤细胞功能降低。恶性胶质瘤干细胞（GSCs)是肿瘤发生和转移的来源，它在体外对NK细胞介导的杀伤功能很敏感，但在体内却可以通过激活TGFβ信号通路来逃避NK细胞的杀伤。在患者来源的恶性胶质瘤异体移植模型中，抑制整合素或TGFβ信号通路或者对同种异体NK细胞TGFβR2进行基因编辑均能够避免GSC诱发的NK细胞功能障碍，从而有效的控制肿瘤的发展。总之，在恶性胶质瘤患者中存在多种免疫细胞耗竭的状态，难以被免疫检查点抑制剂治疗逆转。

细胞免疫治疗能够逆转免疫细胞耗竭么？理论上来说，在免疫异质性TME之外的免疫治疗应该可以避免免疫耗竭，然而以CAR-T细胞为基础的CNS肿瘤治疗却由于肿瘤的高度异质性和TME没有足够的抗原分布而严重受限。目前的研究方向是想办法抑制CAR-T细胞的“胞啃作用（trogocytosis），但还有众多的其它挑战需要解决，包括不同的胶质瘤区域缺乏统一类别的天然T细胞群或CAR-T细胞（这些细胞通常零散分布于肿瘤-脑交界区及血管旁区域）、高度异质性抗原表达以及免疫逃逸，缺乏胶质瘤特异性免疫靶抗原、长期使用免疫抑制的激素、以及标准治疗的先后顺序问题。

如前所述，恶性胶质瘤TME中占主导地位的是髓源性抑制细胞，它能够使本来就很少的T细胞失去功能。很多研究结果证实，恶性胶质瘤患者TME中有多种髓源性细胞群不能吞噬肿瘤细胞，进而将抗原呈递给T细胞。因此想要引发有效的抗肿瘤免疫反应，需要固有免疫同适应性免疫的配合。因此目前有多种新靶向固有免疫和适应性免疫的联合疗法出现（图2）。

1）  集落刺激因子1受体：(CSF1R)其功能是刺激巨噬细胞增殖和生存。临床前研究给予CSF1R抑制剂后，显示能够诱导巨噬细胞向炎性抗抗肿瘤（M1型）表型转化，延缓肿瘤进展。在另一项临床前研究中，CSF1R抑制剂能够调节由树突细胞疫苗诱导的髓源性抑制细胞群，联合PD-1抑制剂后能够显著延长小鼠胶质瘤模型的生存（50%生存超过80d），然而CSF1R单药治疗并未看到显著的临床获益，提示联合作用的必要性。

2） SIRPα–CD47通路：是巨噬细胞和其它天然免疫细胞吞噬的免疫检查点，可能成为脑胶质瘤治疗的新靶点，它广泛表达于多种骨髓细胞，包括巨噬细胞，小胶质细胞，树突细胞和中性粒细胞，其配体是CD47,广泛表达于非肿瘤细胞。CD47在多种肿瘤中上调，包括胶质瘤，能使肿瘤避免被吞噬来逃脱抗肿瘤免疫。抗CD47联合放疗或替莫唑胺能够使临床前胶质瘤模型肿瘤缩小并延长生存。有报道证实抗CD47联合替莫唑胺能够激活cGAS–STING通路，使肿瘤细胞被吞噬，增强抗原交叉呈递以及刺激APCs的cGAS–STING通路，从而促进T细胞活化为效应T细胞或记忆性表型。由于联合治疗同时也能诱导PD-1和PD-L1的表达，因此联合PD-1抗体治疗能够进一步延长生存。

3）STING（stimulator ofinterferon genes） 激动剂能够诱导T细胞向肿瘤区浸润，从而激活原本缺乏炎症的免疫“冷肿瘤”，因而目前在胶质瘤治疗中受到高度关注。它是细胞应激的传感器，通过引发干扰素释放及顺式激活骨髓细胞而成为固有免疫和适应性免疫之间的桥梁，目前新型STING激动剂用于治疗恶性胶质瘤的研究正在准备中。

图2. 脑胶质瘤和脑转移癌患者主要的免疫细胞群体和潜在的免疫治疗靶点

通常我们认为PD-1抑制剂的作用机制是通过作用于效应T细胞。然而PD-1也广泛表达在天然免疫细胞上，包括巨噬细胞，来限制它的吞噬功能，那PD-1抑制剂是否有可能通过影响固有免疫来达到抗肿瘤效应呢？我们用基因工程小鼠制作胶质瘤模型，同时敲除Cd8 以确定CD8+ T对恶性胶质瘤的作用。我们观察到静脉给予PD-1抗体后小鼠得到了生存获益，并且即使在Cd8 敲除后PD-1抗体的作用也一直持续。在Cd8–/–小鼠的TME中我们检测到丰富的CD11b+和Iba1+单核细胞和巨噬细胞。TME中单核和巨噬细胞的存在提示PD-1抗体引发了促炎性反应，使巨噬细胞向MI型转化，清除了PD-1阳性的小胶质细胞和巨噬细胞。因此恶性胶质瘤的抗PD-1治疗或许主要由固有免疫系统介导而非CD8+T细胞介导。因此作者认为

1）恶性胶质瘤患者应用ICIs的生物标志物并不一定是反映了CD8+ T细胞功能。

2）包含固有免疫调节的联合治疗策略或许应该优先基于抗PD-1抗体能够诱导向MI型巨噬细胞转化。

3）任何有前景的临床研究结果应该要用能否激活或极化小胶质细胞或巨噬细胞表型变化来作为对ICIs有反应的标志。

总之，越来越多的研究结果证实目前免疫治疗的有效性和生物标志物之间的关系并非适用于所有瘤种，尤其是CNS肿瘤。短时间内，我们应该聚焦在用抗CD47抗体、STING激动剂和CSF1抑制剂调节固有免疫系统。对于药品研发企业，在对临床免疫难治性瘤种进行临床试验之前应该先进行基础检测步骤，包括检测药物能否恢复患者免疫学的功能、能否引发足够数量的免疫细胞迁移以及效应细胞功能的持久改变，这样才能最大程度的减少临床研究中由于无法解释的偏倚而造成的假阳性结果。最后作者呼吁提供研究基金支持的组织不要支持那些以假想为依据的研究，而应该支持那些有明确生化基础依据的临床研究。

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