马奶酒（koumiss）由马乳自然发酵产生，在蒙古草原有着悠久的消费历史。传统上，马奶酒是用上一年或前一批褐蘑菇中保留的天然微生物进行发酵，将生马乳装在木桶、瓷罐或动物皮中，在室温下发酵1～3 d制成的。最初的生马乳可能存在细菌污染，而马奶酒的生产过程均为开放式自然发酵，没有任何高温灭菌，因此认为马奶酒在自然发酵过程中会自发形成许多抑菌物质，其中抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）具有很大的研究价值。在以往的研究中，从马奶酒中分离鉴定出一些具有抑菌功能的益生菌，如干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）。然而，对马奶酒中AMPs的研究是有限的。AMPs的长度通常为12～50 张凤梅个氨基酸，由于其低分子质量、易于合成、对代谢物无毒以及易于进入细胞而受到广泛关注。AMPs通常是两亲性的，并携带2～9 个净正电荷。AMPs的正电荷引导它们到达带负电荷的细菌细胞膜，使得它们能够破坏细胞膜并导致细胞内容物泄漏，最终诱导细胞死亡。同时，AMPs还可以干扰蛋白质，对细菌、真菌和一些寄生虫显示出多种抗菌活性。值得注意的是，一些AMPs以无活性形式存在于蛋白质序列中，通过微生物胃肠道消化、发酵、酶解或加工贮藏的蛋白质水解可以产生具有不同生物活性的多肽，其中，微生物发酵是最经济、最有效的方法。尽管AMPs具有广阔的应用前景，但传统方法鉴定AMPs的研究仍然有限。肽组学技术是蛋白质组学的一个新兴领域，是一种通过现代分离、分析和计算技术对各种生物样品中的肽进行综合分析的方法。由于其可以高效、快速、完整地研究各种生物体内内源性肽的组成和含量，肽组学技术已成为食品和药物研究领域的新研究方法。由于乳制品营养丰富，因此容易受到微生物污染。金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是乳制品中的一种耐高温食源性病原体，因此高温灭菌并不能完全消灭它们。利用食品中固有的AMPs控制食品中的金黄色葡萄球菌更为安全有效。马奶酒有一定的抑菌潜力，然而，马奶酒中AMPs的综合纯化与表征相关研究比较少。内蒙古农业大学食品科学与工程学院Zhang Mengmeng、Shuang Quan、Xia Yanan、Zhang Fengmei等利用肽组学技术研究马乳和马奶酒多肽的组成和差异，并通过AMPs数据库筛选和预测具有抑菌潜力的多肽。对筛选的AMPs进行化学合成，并通过电子显微镜等方法证实其抗菌活性，揭示其抗菌机制。研究为从马奶酒衍生蛋白的产物中高效筛选AMPs提供了理论基础。马乳和马奶酒的10 kDa片段中有46.75%（1 113）的肽序列相同，53.25%（1 268）的肽序列不同，这些肽的长度大部分为10～50 个氨基酸。如图1e所示，发现显著调控的主要肽段来源于β-酪蛋白（Q9GKK3）和αs1-酪蛋白（A0A3Q2HHX1）。酪蛋白是马奶酒中含量最丰富的蛋白质。此外，微生物生物合成的酶主要定位于细胞外基质（39.53%）和线粒体（30.23%）。a
：肽段总数的比较；b：不同分子质量范围的肽段数；c：N-末端氨基酸的相对丰度；d：C-末端氨基酸的相对丰度。e：火山图；f：基因本体和通路分析；g：亚细胞定位；h：蛋白质直系同源群簇；i：京都基因和基因组数据库Pathway-Based富集分析。图2c和图2d显示，马奶酒衍生的AMPs具有典型的多肽特征，具有正电荷、碱性和疏水抗菌活性。圆二色光谱下，MP-4在190～260 nm波长范围内，最大吸收波长为206 nm，呈现明显的负吸收带。在218～225 nm也表现出不显著的负吸收带。206 nm和220 nm附近的双负峰代表了表面AMPs二级结构中的α-螺旋和 张凤梅β-折叠。AMPs MP-4对pH值和热环境敏感性的测定结果表明，MP-4在酸性pH值下表现出良好活性，在碱性pH值下抗菌活性进一步增强。图2 a：AMPs MP-4的远紫外线圆二色谱图；b：AMPs MP-4在不同pH值下抑制率变化；c：AMPs MP-4在不同温度下的抑制率变化鉴定的肽中，通过AMPs数据库中预测肽序列的得分以及对其抗菌活性和稳定性的验证，共鉴定出5 个具有高抗菌潜力的新AMPs。5 种多肽均对金黄色葡萄球菌具有抗菌活性结果显示，最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）值为32～512
μmol/L。AMPs MP-4对金黄色葡萄球菌的MIC为32 μmol/L，最小杀菌浓度（minimum bactericidal concentration，MBC）为128
μmol/L，具有最佳的抗菌效果。表1 AMPs对金黄色葡萄球菌的MIC和MBC
如图3a所示，处理后细胞内蛋白浓度显著高于对照组（未经AMPs MP-4处理）。利用扫描电镜比较MP-4处理后金黄色葡萄球菌表面形态和结构的变化，可以看出，对照组的细菌表面形态完整，结构完整，没有皱纹、凹陷、断裂。采用透射电镜观察AMPs MP-4处理前后细菌超微结构的变化。在没有AMPs ?MP-4处理的情况下，细菌细胞结构完整，细胞膜清晰可见。a：MP-4对金黄色葡萄球菌培养物中蛋白质含量百分比的影响；b：未经MP-4处理的金黄色葡萄球菌细胞流式图；c：MP-4处理金黄色葡萄球菌2 ?h的流式图；d：未经MP-4处理的金黄色葡萄球菌的扫描电镜图；e：用MP-4处理金黄色葡萄球菌的扫描电镜照片；f：未经MP-4处理的金黄色葡萄球菌的透射电子显微镜照片；g：经MP-4处理的金黄色葡萄球菌的透射电镜图。a'、b'、c'、d'依次为a、b、c、d的放大图。
研究发现MP-4具有抑菌活性，抑菌效果显著且稳定。AMPs MP-4可以通过改变金黄色葡萄球菌的形态，诱导其蛋白渗漏而杀死金黄色葡萄球菌。综上所述，MP-4是一种从马奶酒中提取的新型AMPs，对金黄色葡萄球菌具有良好的抗菌性能，为马奶酒衍生多肽的应用提供了理论基础。
张凤梅
文章《A novel endogenous antimicrobial peptide MP-4 derived from koumiss of Inner Mongolia by peptidomics, and effects on Staphylococcus aureus》发表于LWT 2023年11月29日内蒙古农业大学食品科学与工程学院双全教授、夏亚男副教授、张凤梅副教授为本文共同通信作者文章链接：https://doi.org/10.1016/j.lwt.2023.115595
双全，博士、教授、博士生导师。研究领域及方向为乳酸菌功能特性、传统乳制品研究与开发，以及肉制品加工。开设的课程《乳与乳制品工艺学》、《肉与肉制品工艺学》、《生命科学研究进展》、《原料乳生产及质量控制》。夏亚男，现任内蒙古农业大学副教授、内蒙古畜产品加工研究会副秘书长。主持：1.中央引导地方科技发展资金项目子课题，低盐发酵腌制菜标准化生产关键技术研究与产业化；2.中央引导地方科技发展资金项目子课题，内蒙古发酵牛肉干标准化生产关键技术研究与示范；3.内蒙古自治区科技计划子课题，功能型黄柿子调味制品高质化生产关键技术与示范；4.内蒙古自治区科技计划子课题，锡林郭勒奶酪标准化生产关键技术与示范，等科研项目。张凤梅，博士、副教授、硕士研究生导师。主要研究方向为功能性食品的研究开发，食品免疫科学、蛋白质科学、营养学。研究课题为乳蛋白质为原料的非抗原性免疫调节肽的开发。新刊启动| Food Science of Animal Products《动物源食品科学》（英文），欢迎投稿
Food Science of Animal Products（ISSN: 2958-4124, e-ISSN: 2958-3780）是一本国际同行评议、开放获取的期刊，由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心主办，中国食品杂志社《食品科学》编辑团队运营，属于食品科学与技术学科，旨在报道动物源食品领域最新研究成果，涉及肉、水产、乳、蛋、动物内脏、食用昆虫等原料，研究内容包括食物原料品质、加工特性，营养成分、活性物质与人类健康的关系，产品风味及感官特性，加工或烹饪中有害物质的控制，产品保鲜、贮藏与包装，微生物及发酵，非法药物残留及食品安全检测，真实性鉴别，细胞培育肉，法规标准等。https://www.sciopen.com/journal/2958-4124
